微生物发酵部分知识总结

绪论
微生物工程的发展史和发展方向
１、天然发酵阶段  特点：产品质量不稳定。
２．纯培养技术的建立，使发酵技术从天然发酵转变为纯粹培养发酵，实现了第一个技术进步（或称转折）。
3．通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业的最主要的生产方式。这是发酵技术进步的第二个转折点。特点：发酵工业从利用分解代谢转向合成代谢。
4．人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立
代谢控制发酵技术以动态生物化学和微生物遗传学为基础，将微生物进行人工诱变，得到适合于生产某种产品的突变株，再在人工控制条件下培养，即能选择性地大量生产人们所需要的物质。人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立，是发酵技术发展的第三个转折点。
代谢控制发酵技术是通过选育突变株，从DNA水平上控制微生物的代谢途径，积累大量有用发酵产物的技术。特点：直接发酵。
5．基因工程育种阶段  人为创造“物种”，建立工程菌株，这应该是第四个转折点。特点：建立工程菌株。
综合生物工程技术，这个阶段正在发展时期，是微生物工程的发展方向。
1、什么是代谢控制发酵2、什么是混合发酵和纯种发酵？二者的区别？3、什么是工程菌？
第二章  微生物工业用菌种
微生物工业对菌种的要求
1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和生成所需的代谢产物产量高。
2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵。
3、生长速度和反应速度较快，发酵周期较短。
4、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型或调节突变株或野生突变株。
5、抗噬菌体能力强，不易被感染。
6、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产量质量的稳定性。
7、菌体不是致病菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。
工业用微生物菌种的来源主要有三条途径
1、从自然界分离出来的野生株（主要是土壤中）2、经过诱变的菌株3、通过DNA重组的工程菌(4、原生质体融合）
原核微生物
一．革兰氏阴性无芽孢杆菌
1、大肠埃希氏菌（Esherichia coli）2、醋酸杆菌（Acetobacter) 3、假单胞菌(Pseudomonas)
二．革兰氏阳性无芽孢杆菌
1、短杆菌(Brevibacterium)2、棒状杆菌(Corynebacterium)3、乳酸杆菌(Lactobacillus)        4、双歧杆菌(Bifidobacterium)
5、丙酸杆菌(Propionibacterium)
三、革兰氏阳性芽孢杆菌
1、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)2、其他芽孢杆菌(Bacillus)3、芽孢梭菌(Clostridium)
四、革兰氏阳性球菌
1、微球菌(Micrococcus)2、链球菌(Streptococcus)3、明串珠菌(Leuconostoc)
五、放线菌（actinomycetes)
1、链霉菌属(Streptomyces)        2、链轮丝菌属 (Strptoverticillum)3、诺卡氏菌属(Nocardia)4、小单胞菌属(Micromonospora)5、链孢囊菌属(Streptosporangium)6、游动放线菌属(Actinoplanes)
六、蓝细菌(cyanebacteria)
形态结构：细胞壁与G-相似，形态差别很大，球、杆形的单细胞或丝状细胞链两种形态。只有少数为化能异养型,多数为专性光能自养。营养要求简单，不需维生素，只要有空气、阳光、水和少量的无机盐类，就能大量生长繁殖。
真核微生物
一、酵母菌(yeast)
1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)     
2、卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis ） 、
3、异常汉逊氏酵母（Hansenula anomala)  
4、假丝酵母(Candida Berkhuot)
5、球拟酵母(Torulopsis Berlese)           
6、红酵母（Rhodotorula Harrison)
二、霉菌（mold)
1、根霉（Rhizopus)2、毛霉(Mucor)3、梨头霉(Absidia)4、曲霉(Aspergillus)5、红曲霉(Monascus)
6、青霉(Penicillium)7、头孢霉(Cephalosporium)8、木霉(Trichoderma)9、白地霉(Geotrichum)
10、弯孢霉(Curvularia)
三、担子菌（basidimycetes)
四、藻类
五、原生动物
非细胞生物
噬菌体和病毒
在以细菌和放线菌为菌种的工业微生物发酵生产中，有时会出现噬菌体的感染。
应用：诱导干扰素产生；基因工程载体；制备疫苗；灭活疫苗，减毒疫苗，基因工程疫苗。
总结第二章
1、发酵工业对菌种的要求7条；主要来源3个。
2、工业微生物的主要功能6个：
   1）生产菌体蛋白：酵母，藻类。
   2）生产有机酸：醋酸杆菌，乳酸杆菌，假单胞菌，芽孢梭菌，黑曲霉
   3）生产抗生素：枯草杆菌，链球菌，放线菌、霉菌
   4）生产生物活性物质：棒状杆菌，短杆菌，枯草杆菌，放线菌、酵母、霉菌
   5）环境治理：假单胞菌，霉菌，放线菌，藻类，原生动物
   6）食品、药品、保健品：乳酸杆菌，双歧杆菌，蓝细菌，担子菌，白地霉
3、菌种与产品
   1）多个菌种可生产同一物质，但有主次之分，如：
         柠檬酸：黑曲霉，假丝酵母，球拟酵母
         啤酒：卡尔斯伯酵母，酿酒酵母
         酒精：酿酒酵母，乳酸杆菌（异型乳酸发酵），肠膜明串珠菌（异型酒精发酵）
         青霉素：产黄青霉，点青霉
         淀粉酶：枯草杆菌，链霉菌属，根霉，毛霉、曲霉
维生素B12：丙酸杆菌，链霉菌属，巨大芽孢杆菌
谷氨酸：棒状杆菌，短杆菌
曲酒：霉菌，酵母，醋酸杆菌
2）一个菌种可产多种产品，可进行代谢控制发酵或用其主要功能
      黑曲霉：柠檬酸，蛋白酶，葡萄糖酸
      酿酒酵母：酒精，白酒，转化酶，药用，VD2
      大肠杆菌：用作工程菌，生产肽，激素等
      棒状杆菌：谷氨酸，核苷酸，水扬酸
      双歧杆菌：药用，保健品，乳制品
      芽孢梭菌：丙酮—丁醇发酵，丁酸，己酸
      放线菌：抗生素，酶制剂，抑酶因子
      担子菌：食用，提取生物活性物质
3）经过改造的菌种可用于人为目的
        大肠杆菌：基因工程受体菌
        噬菌体载体：M13，λ
        假单胞菌：分解石油的超级细菌
        酵母：酿酒，生产蛋白亚单位疫苗（如乙肝疫苗）
4、可作为工程菌或常用的其它种类
        大肠杆菌，枯草杆菌，假单胞菌，酵母菌，噬菌体和真核细胞病毒
5、多个菌种可混合使用
      1）如  双歧杆菌，嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌保加利亚乳杆菌等，可制成功能食品；
      2）短双歧，长双歧，青春双歧，婴儿双歧，两歧双歧等，可制成微生态制剂；
      3）药用酵母：酿酒酵母，卡尔斯伯酵母
      4）生产菌体蛋白：假丝酵母，球拟酵母
      5）酒曲：毛霉，曲霉，根霉
      6）多价疫苗：如痘病毒载体—狂犬病、乙 肝、爱滋病等多价疫苗
第一、二章复习思考题
1、试说明什么是初级代谢产物和次级代谢产物？
2、微生物工业对菌种的要求及其来源。
3、试说明青霉素、链霉素、四环素、红霉素及肽类抗菌素的主要生产菌。
4、试述工业用微生物在发酵生产中的主要应用范围。
5、说明下列产品的主要生产用菌种：
      柠檬酸，啤酒，酒精，青霉素，谷氨酸，淀粉酶，丙酮—丁醇，VB12，VC，生长素，食醋，面包酵母，乙肝疫苗
第三章 工业用培养基及其制备
工业用培养基的要求
1）能从所使用的单位质量的基质中获得产物（或生物）的最大产量。
2）在发酵胶中获得产物（或生物）的最大浓度。
3）可以达到产物形成的最大速率。
4）不希望获得的副产品收获量最少。
5）培养基原料廉价、质量稳定、而且全年均可得到供应。
6）生产过程中，在通气和搅拌、产物萃取或提取、产品纯化的过程中产物稳定。
7）废物、废液处理等方面的问题最少。
培养基的营养成分
1、碳源：糖类、脂肪、某些有机酸及一些石油化工产品  2、氮源：有机和无机两类  3、无机盐类：少量元素和微量元素
4、生长因子：生物素等  5、水：溶媒，生化反应
培养基 根据营养物来源分 ：
1、天然培养基：动、植物、微生物原料构成。
2、合成培养基：化学成分和数量完全清楚。
3、半合成培养基：在合成培养基中加入某种天然成分或天然培养基中加入化学成分。
根据制成形式分：
1、液体培养基：营养成分溶于水，无明显固形物。
2、固体培养基：加入凝固剂—琼脂、硅酸等。工厂中的固体物料—酱油、酒等。
根据主要成分和使用目的分
1、基础培养基：最低限度培养基，缺少生长因子，野生型可以生长。
2、完全培养基：能满足各种营养缺陷型菌株的生长。基础+天然物质。
3、选择培养基：促进目标菌生长或抑制非目标菌生长。
4、鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现明显差别。
根据生产工艺的要求分：
1、孢子培养基： 是供制备孢子用的。要求这类培养基能使菌体形成大量孢子，但不引起菌种变异。一般基质浓度特别是有机氮源浓度低一些，无机盐浓度适量。（生产中常用麸皮培养基，大（小）米培养基，由葡萄糖或淀粉、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基等。
2、种子培养基： 为保证发酵工业获得大量优质菌种而设计。是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。营养成分应是易于菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完整。一般氮源比例较高。
3、发酵培养基：  是供生产菌生长和合成代谢产物用的。要求营养要适当丰富和完备，原料来源广泛，成本低。培养基的成分比例比较粗略，碳源比例大，PH值适当而稳定。糖、氮代谢能完全符合高单位罐批的要求。
发酵培养基的选择
选择规则和程序如下：
1、调研。1）了解菌种的来源，生活习惯，生理生化特征，营养要求等。2）培养条件，合成代谢途径，产物化学性质，分子结构，纯化方法，质量要求等。
2、试验比较1）不同配方的比较2）同一配方改进前后的比较3）单种营养成分来源和数量的比较4）几种营养成分浓度比例调配的比较5）小型试验放大到大型试验的比较，有两种方法：优选法与正交设计；生长谱法。
3、补料及代谢控制
某些微生物生长和产物合成对培养基的要求不同，这样培养过程中一方面要控制碳氮配比，另一方面还应加入各种养料和前体物质，引导发酵走向合成产物的途径。
淀粉水解糖的制备
微生物工业中大多数生产菌种都不能直接利用或微弱利用淀粉、糊精为碳源。在发酵生产之前，必须将淀粉质原料水解成葡萄糖，才能供发酵使用。   淀粉水解糖的制备方法
在工业上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化
淀粉水解糖的制备方法
1、酸解法：也称酸糖化法。它以有机酸或无机酸为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。特点：1）生产简易2）时间短3）设备生产能力大4）设备要求耐腐蚀，耐高温、高压。5）对淀粉原料要求严格6）有副反应发生，淀粉转化率相对较低
2、酶解法：使用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，分两步进行，第一步称为“液化”，是利用
α-淀粉酶将淀粉液转化成糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加。第二步是“糖化”，利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转化为葡萄糖。--------双酶法
优点：1）酶解的反应条件温和。不需要耐高温高压的设备。2）淀粉的转化率高，糖液纯度高，副反应少。3）可在较高淀粉浓度下水解4）由于所用微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可以简化。5）糖液颜色浅，较纯净，无苦味，质量高，有利于糖液的精致。
缺点： 反应时间长（2-3天），要求设备多。
3、酸酶结合法 是集酸法和酶法制糖的优点而采用的结合生产工艺。根据原料淀粉的性质可分为：
1）酸酶水解法—事先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后用糖化酶将其水解为葡萄糖。（原料：玉米，小麦等谷类淀粉，淀粉颗粒坚实，不易用酶液化。）
特点：酸液化速度快，糖化由酶来进行，可采用较高的淀粉乳浓度。
2）酶酸水解法—是将淀粉用α-淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖。（原料：淀粉颗粒不均匀的淀粉。如碎米淀粉。）
特点：能用粗原料淀粉，淀粉浓度高，时间短，副反应少。
  总之，从水解糖液质量和降低糖耗，提高原料利用率方面，双酶法最好，其次酸酶法，酸法最差。从时间讲，酸法最短，双酶法最长。
糖蜜是糖厂产糖的副产物，又称桔水。糖蜜中含糖量很高，在50%以上，是一种非结晶糖分。
糖蜜中干物质的浓度很大,如果不进行处理,微生物无法生长和发酵.
糖蜜前处理的方法  处理程序包括:稀释，酸化，灭菌及澄清等过程.主要有三种方法.
1、加酸通风沉淀法2、加热加酸沉淀法3、添加絮凝剂澄清处理法。
发酵过程中的前体物质、促进剂和抑制剂
前体物质：
在氨基酸、抗生素、和酶制剂发酵过程中，可以在发酵培养基中加进某些对发酵有一定促进作用的物质，称为促进剂或刺激剂。抑制剂是指能够抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一类代谢途径，以至可以改变微生物代谢途径的物质。使产量增加的主要原因是改进了细胞的渗透性，同时增强了氧的传递速度，改善菌体对氧的有效利用。
常用的促进剂有各种表面活性剂（如洗涤剂、吐温80 、植酸、洗衣粉等）、二乙胺四乙酸、大豆油精抽提物、黄血盐、甲醇等。
第三章复习思考题
1、发酵工业用培养基的类型有哪些？ 2、选则发酵培养基的一般应遵循什么样的规则和程序？3、淀粉水解糖的制备方法有几种？各有什么特点？ 4、工业用微生物培养基的基本要求。 5、名词解释：孢子培养基；种子培养基；发酵培养基。
第四章  菌种选育与扩大培养
一、菌种选育
概念：是指按照生产的要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选得到目的菌株。
目的：就是要改善菌种的特性，使其能提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用等。
菌种选育常用方法：
自然选育：从自然界中选育。
诱变育种：一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基发生突变，改变蛋白质的结构和功能，从而使细胞的功能发生改变。
代谢控制育种：有两个方面，1）改变代谢通路的育种；2）改变代谢自动调节系统的育种（主要是解除反馈抑制和反馈阻遏）。
杂交育种：细菌、放线菌、霉菌、酵母的杂交；细胞杂交。
基因重组育种：通过基因重组而表达特异产物。一般有转化、转导、杂交等。
自然选育：利用微生物的自然突变进行菌种选育。自然突变有两种结果：退化---产量或质量下降；正变---增加产量。缺点：效率低解决办法：与诱变选育交替使用。
诱变育种：理论基础：染色体畸变和基因突变基本方法：物理、化学、生物诱变；复合诱变。
基本步骤：出发菌株的选择----诱变剂的使用----诱变剂的剂量选择----突变菌株的筛选----保种
代谢控制育种：改变微生物的遗传型，获得具有目的遗传标记的突变株（定向育种）。常用诱变或细胞内基因重组等育种技术。
有用菌种的分离筛选程序
1、菌种分离、纯化和筛选的一般步骤
标本采集 标本材料的预处理 富集培养 菌种初筛 菌种复筛 性能鉴定 菌种保藏
种子扩大培养的任务和方法
任务：1）获得纯而状的培养物；2）获得活力旺盛，数量足够的培养物。（纯，壮，活，量）。
工业微生物的培养类型
静置培养：将培养基盛于发酵槽中，在接种菌种后不通空气进行培养发酵，又称嫌气性发酵。如酒精、丙酮、丁醇和乳酸等。
通气培养：以需氧菌和兼性厌氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，菌体才能迅速生长和发酵，又称好气性发酵。如谷氨酸、核苷酸、有机酸、酶制剂等。
影响种子质量的主要因素
培养基：不同的微生物所需要的培养基的成分和浓度有所不同，必须按照实际情况加以选择。一般来讲，种子罐是培养菌体的，培养基的糖分要少，而对微生物生长起主导作用的氮源要多，而且其中无机氮源所占的比例要大一些。种子罐和发酵罐的培养基成分趋于一致较好，这样可以使处于对数生长期的菌种移植在适宜的环境中发酵，缩短生长过程的缓慢期，立即实施代谢功能。
种龄与接种量 种子培养期应取菌种的对数生长期。种龄过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。大量地接种成熟的种子，可以缩短生长过程的迟缓期，因而缩短发酵周期。接种量影响发酵周期的原因，是由于在大量接种过程中把微生物生长和分裂所必需的代谢产物（可能是RNA)一起带进去，从而有利于微生物立即进入对数生长期。
温度   温度对微生物的影响，不仅影响表面，而且影响其体内的酶系的活动。温度与微生物生长的关系，一方面，在其最适温度范围内，生长速度随温度的升高而增加；另一方面，不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。
迟缓期：对温度敏感。最适温度下可缩短迟缓期  对数生长期：温度的影响较弱。生长后期（稳定期、衰亡期）：主要取决于溶氧，而不是温度。孢子萌发期：萌发的时间随温度的上升而缩短
PH值  培养基的氢离子浓度对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与酶合成所需的最适PH范围。同一种菌合成酶的类型与酶系的组成可以随PH值的改变而发生不同程度的变化。如：
黑曲霉：   PH>6.0  果胶酶活性受抑制  PH<6.0  形成果胶酶  泡盛曲霉突变株：PH=6.0   产α-淀粉酶   PH=2.4   产糖化性淀粉酶和麦芽糖酶     调节方法：1）酸碱调节2）缓冲液3）生理缓冲剂
通气和搅拌  需氧菌和兼性厌氧菌的生长与酶合成都需要氧的供给。不同的微生物通气量要求不同，即使是同一菌种不同生理时期要求也不同。通气能供给大量的氧，而搅拌则能使通气效果更好。  剧烈搅拌有负面影响：起泡，酶氧化，破坏菌种细胞，易染杂菌。
泡沫  培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关。泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵。 产泡的原因：通气和搅拌；成分变化。
去除： 消泡剂。主要是表面活性剂和植物油。
染菌的控制 原因：设备，管道，阀门漏损，培养基灭菌不彻底，空气净化不好，无菌操作不严格或菌种不纯。
解决办法：接种室消毒灭菌；纯菌；实罐灭菌等。
种子罐的级数  种子罐级数越少越有利于简化工艺及控制。种子罐的级数决定于菌种的性质、孢子瓶中的孢子数、孢子发芽和菌丝繁殖速度、发酵罐中种子培养液的最低接种量、种子罐与发酵罐的容积比等。如孢子多、发育快、接种量少，则一般选择二级发酵。
第三、四章复习思考题
1、对工业用生产菌种的基本要求 2、筛选工业用菌种的一般过程 3、菌种选育的方法  4、种子扩大培养的任务  5、影响种子质量的主要因素

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