基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）

基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）技术在理论上来说可以检测到一个细胞内所有转录体的表达，而且可以给每一个转录体定量，不管它是低丰度还是高丰度。SAGE和基因芯片技术一样，具有高通量、平行性检测细胞内基因表达谱的特点。但SAGE可在未知任何基因或EST序列的情况下对靶细胞进行研究，这一点是基因芯片技术所不具备的。

基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是1995年Velculescu提出的，是近几年来发展起来的一种快速分析基因表达信息的技术。它通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息。它的显著特点是能够大量获取基因组范围基因表达的类别与丰度。SAGE技术已成功地应用于特异组织或细胞的转录组研究和mRNA群体间差异表达基因的鉴定。基因表达系列分析（SAGE）以构建能独特代表基因转录本序列的标签（tag）为宗旨，标签长度约9～12 bp，同一tag 在某组织中出现的频度反应了该tag 所代表基因在这种组织中的表达丰度。目前，NCBI 通过Internet 操作平台提供了多种来源的肿瘤组织、细胞系及相应正常组织近100个SAGE 文库数据，为能找到代表性SAGEtag 的基因进行多组织P细胞间表达谱量化分析、比较、甚至功能推测提供了良好的“实验”材料和环境。

SAGE技术得以建立的理论基础

1.一段来自于任一转录本特定区域的“标签”（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。例如：一个9碱基的序列能有四的9次方，即262144种不同的排列组合，而人类基因组据估计仅编码80000种转录本，因此在理论上每一个9碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。
2.如果将短片段标签相互连接、集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式进行处理，这样就可对数以千计的mRNA转录本进行批量分析。
3.各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数定量。

SAGE与其他技术的区别

SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略。并可在此基础上，发现新的基因。

SAGE应用

SAGE还可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速。目前，使用这一策略已发现了许多在癌症中呈现上调表达的基因。这些基因，尤其是正常组织中缺乏的基因，很可能成为有用的诊断和预测指标或潜在的治疗位点。

SAGE的功能

SAGE是构建cDNA文库和分析基因表达的新方法。对于含量低且种类繁多的基因，使用SAGE产生的表达图谱识别新的基因经常会有满意的结果。

SAGE的原理

从三方面保证能唯一性的鉴定转录本并精确的反映其表达丰度。首先，SAGE从每个转录本特定位置唯一性的截取10－11bp的序列，该序列即为SAGE标签。通过测序，特定标签的出现数目就可以反映它所代表的转录本的表达丰度。其次，为了克服这种基于测序的方法可能存在的通量限制，SAGE采取了系列化处理，从而测得的每个序列可以包含25－50个标签。最后，同其他方法一样，SAGE也采用了聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增，但是，特定的识别机制避免了可能产生表达谱的扩增偏倚（Amplification Bias）。

具体的实验路线：

1.以oligo（dT）为引物反转录合成cDNA，以一种限制性内切酶（锚定酶）酶切。
2.将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶酶切位点序列。
3.用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段（约9～10碱基），混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。
4.用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签（Ditga）片段并克隆、测序。

SAGE的主要过程分为三个阶段：

第一阶段是SAGE文库的构建。包括五个步骤： 1、双链cDNA的获得。mRNA逆转录生成双链cDNA，一链合成的引物为5`端生物素修饰的Oligo（dT）； 2、生物素化的3`-cDNA的获得。生成的双链cDNA用限制性内切酶NlaIII（锚定酶，anchoring enzyme）进行酶切，该酶能够识别CATG位点并在其3`侧进行酶切；得到的生物素化的3`-cDNA用链霉亲和素包被（streptavidin-coated）的磁珠进行亲和纯化； 3、带接头的SAGE标签的获得。分离得到的cDNA的5`端被补平，并分成两部分，分别接上接头（linker）A或B，该接头包含CATG四碱基突出端、II性限制性内切酶（BsmFI）的识别序列和一个PCR引物的序列（引物A或B）；连有接头的cDNA用BsmFI（标签酶，tagging enzyme）进行酶切，该酶在其识别位点3`端下游的14－15bp处进行酶切，从而每条cDNA释放出一个带有接头的SAGE标签（tag）。需要说明的是，BsmFI酶切的位置20％在其识别序列的14bp下游，80％在15bp。 4、SAGE双标签的获得。A和B两部分的带有接头的SAGE标签分别用DNA聚合酶（Klenow酶）进行末端补平，混合，并用连接酶（ligase）进行连接。得到的带接头的双标签（lingker-adapted ditag）用引物A和B进行PCR扩增，NlaIII酶切释放出引物结合体（primer-adapter），PAGE胶分离得到纯化的SAGE双标签（SAGE ditag）。 5、SAGE双标签多聚体的获得以及克隆。SAGE双标签用T4 DNA连接酶连接成多聚体（concaterner），选择合适的片断长度，克隆至高拷贝的克隆载体。得到的克隆插入序列由一系列的20-22bp长的SAGE双标签组成，每两个双标签中间由4bp的NlaIII酶切位点分隔开。

第二阶段是SAGE文库的测序。利用质粒载体上的通用引物，对插入片断进行单向测序。SAGE要求高质量而且长读长的序列，因为单碱基测序错误会导致原有标签的有用信息的丢失而产生一个并不存在的标签。

第三阶段是标签序列的提取。标签序列的提取工作可以由SAGEnet提供的SAGE提取软件包（目前为SAGE2000版，可以从http://www.sagenet.org/上免费下载）来完成，也可以使用NCBI （National Center for Biotechnology Information，美国国立卫生院国立生物技术信息中心）提供的高度用户化的UNIX操作系统和C程序（网址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sage）来完成。两者的基本处理过程都是一样的，主要有6个步骤：1、在双标签多聚体序列中定位NlaIII酶切位点（即CATG）；2、提取CATG位点之间的20－26个碱基长的双标签序列；3、去除重复出现的双标签序列，包括在反向互补方向上重复的双标签序列；4、截取每个双标签序列最靠近两头末端的10碱基，即为标签序列；5、去除与接头序列相对应的标签（即TCCCCGTACA和TCCCTATTAA），同时去除含有不确定碱基（即除A、C、T、G四种碱基以外的碱基）的标签；6、计算每个标签的出现次数，以列表的形式给出一个包含每个标签及其表达丰度的报告。

SAGE的方法

I-SAGE试剂盒的方法是使用普通的分子生物技术构建SAGE文库。文库是由特定的14bp片段构建的，这个片段被称作标签，而不是由每个转录的完整序列构成的。这个片段足以特异地识别每个mRNA的转录。将标签连接成串联体克隆，测序（图1）。没有PCR偏差，因为PCR模板是100bp。克隆的串联体高通量的测序识别每个标签。SAGE软件为现在和今后的分析研究储存了序列的档案资料。资料是在比较已知基因时用来查询SAGE图谱的数据库。研究结果可使你检测疾病发展中基因的上，下游调节，测量基因表达时化合物的功效，分析基因表达在不同疾病时期的模式，并且识别新的基因作为药物治疗的目标。

I-SAGE步骤

1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与RNA混合。
2. 合成双链cDNA。
3. 用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签的产物。
4. 将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备用BsmF1消化。
5. 用BsmFⅠ切割每一个样品形成50bp的标签。
6. 延伸5秒，连接成100bp的双链标签。
7. PCR扩增。
8. 用NlaⅢ酶切40bp产物释放26bp双链标签。
9. 连接片断形成串联体。
10. 克隆到pZErO-1+里，并测序。

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